Bioengineering--體外DRG表達Nav1.7/1.8，并導致IL-6 和NGF敏化處理后細胞的自發(fā)/熱激發(fā)興奮性
- 2020-08-24 14:16:00
- 掌柜 原創(chuàng)
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在傷害性刺激下，感覺神經(jīng)元的電壓門控鈉離子通道（特別是Nav1.7和Nav1.8這兩種）會誘發(fā)動作電位，從而將周邊神經(jīng)系統(tǒng)獲得的信息傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。這些通道對于炎性痛的發(fā)生至關重要。我們通過細胞實驗來篩選能夠調(diào)節(jié)電壓門控鈉離子通道的化合物，就是在假定這些體內(nèi)的關鍵離子通道在體外的細胞中也存在的前提下開展的。
之前這方面研究的體外電生理實驗都會用到急性切片組織。然而，要長期維持這種樣本的存活很困難。微電極陣列作為一種潛在的替代技術，可以長期記錄神經(jīng)發(fā)放活動，所以很適合被用來對慢性疼痛的持續(xù)致敏作用開展評估。
在本研究中，我們將NGF和IL-6這兩種和慢性炎性痛相關的炎癥遞質(zhì)加入到（體外培養(yǎng)的）成年小鼠原代DRG神經(jīng)元中，通過MEA實驗發(fā)現(xiàn)樣本的放電頻率會隨之提高。這些樣本中能夠檢測到Nav1.7和Nav1.8蛋白。而將其阻斷后，NGF和IL-6處理所導致的熱激發(fā)放電就會受到巨大的影響。以上結(jié)果說明這兩種離子通道的作用導致了DRG的受激放電。 這項工作著重于MEA在感覺神經(jīng)元藥理學方面的應用，將有助于鎮(zhèn)痛化合物的發(fā)現(xiàn)及其作用機制的分析。
圖1 NGF和IL-6處理會導致小鼠原代DRG樣本急性并可持續(xù)地提高興奮性及熱介導受激發(fā)反應。
這些實驗數(shù)據(jù)表明了，NGF和IL-6能夠顯著地動員靜息態(tài)神經(jīng)元進入興奮態(tài)，并提高樣本整體的發(fā)放數(shù)量。另外，在體外實驗中，它們可能介導了急性和持續(xù)的溫度超敏感性。
圖2 Nav1.7和Nav1.8的選擇性強力拮抗劑能夠抑制敏化后的DRG樣本自發(fā)電活動
A圖為具代表性的活動電極在加藥前（左側(cè)列）和加藥后（右側(cè)列）記錄到的樣本光柵圖對比。所加藥物為各種鈉離子通道亞型的抑制劑。在這之前，樣本已經(jīng)用NGF和IL-6敏化處理了72小時。數(shù)據(jù)計算后（見圖C），我們發(fā)現(xiàn)即使在納摩爾的濃度下，Nav1.7、Nav1.8的抑制劑都能明顯降低DRG樣本的自發(fā)電活動。而中樞神經(jīng)特異性的Nav1.1/1.3拮抗劑卻幾乎無效。
B圖中的實驗，改用分化21天的原代小鼠胚胎皮層神經(jīng)元，以進一步確認在DRG樣本 中觀察到的痛覺特異性離子通道的亞型選擇性調(diào)控現(xiàn)象。 該實驗結(jié)果符合我們的預期：ICA-121-431對皮層神經(jīng)元的自發(fā)電活動有著強烈的抑制效果；相比之下，針對Nav1.7/Nav1.8的兩種拮抗劑產(chǎn)生的效果要弱很多。
圖3 Nav1.7和Nav1.8的強效選擇性拮抗劑能夠抑制敏化DRG樣本的熱激發(fā)反應。在加藥處理前，樣本被MEA檢測到的熱反應通道占比為35%左右。兩種拮抗劑分別將這個數(shù)據(jù)降低到了20%和4%。
將上述三組實驗結(jié)果綜合起來分析，我們能夠證明Nav1.7和Nav1.8的藥理學特性在特外培養(yǎng)的成年小鼠DRG神經(jīng)元中仍然存在。而且在NGF和IL-6介導的超興奮性及熱激誘發(fā)反應的增強上，這兩種離子通道都起到了作用。
共聚焦成像結(jié)果顯示，NGF和IL-6處理組相比對照組而言，Nav1.7/1.8陽性神經(jīng)元的比例并沒有增加(圖A/B)。另外，qRT-PCR檢測(圖C)也顯示，上述兩組細胞在鈉離子通道亞型的表達上也無明顯差異。
之前通過使用臨床前動物模型，人們在體內(nèi)水平展現(xiàn)了Nav1.7和Nav1.8在炎性疼痛以及熱痛敏反應中的作用。只需數(shù)秒鐘，有害溫度就開始發(fā)揮作用。與此發(fā)現(xiàn)相一致的是，在有害溫度下(42℃)，這種疼痛感受器所具備的功能性溫度敏感機制被證明能夠在體外維持并重現(xiàn)。更重要的是，我們觀察到了這種熱介導的受激反應能夠被Nav1.7/1.8的拮抗劑所抑制，這與藥物在體內(nèi)熱痛敏中的作用一致。
與早期的幾篇報道相反，我們發(fā)現(xiàn)NGF和IL-6對于Nav1.7/1.8的表達沒有影響。而且（在體外細胞模型MEA實驗中）發(fā)現(xiàn)敏化處理3小時后，自發(fā)電活動的急性調(diào)控就已經(jīng)發(fā)生了。所以我們傾向于使用一種直接激活模型，即離子通道的異構(gòu)體被直接活化并導致急性痛覺敏感效應，（來解釋這些表型現(xiàn)象。）
綜上所述，這篇文章的數(shù)據(jù)與之前發(fā)現(xiàn)的Nav1.7和Nav1.8異構(gòu)體所具有的在痛覺細胞群體中優(yōu)勢表達的特性相一致。而這種組織型特征有望能夠在體外培養(yǎng)的成年小鼠DRG神經(jīng)元中長期維持。這表明我們所使用的培養(yǎng)方法能夠為Nav1.7和Nav1.8的長期檢測提供穩(wěn)定的平臺。而炎癥遞質(zhì)所導致的DRG神經(jīng)元慢性電生理活動變化的一系列實驗，則突顯了（MEA）表型篩選的有效性。
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